支原體(mycoplasma)屬于細(xì)菌域原核生物界硬壁菌門中低 c、G含量的革蘭陽性桿菌分支柔膜體綱(Mollicutes)，是一類缺乏細(xì)胞壁的原核細(xì)胞型微生物 ，大小介于細(xì)菌與病毒之間，呈高度多形性，有球形、桿形、絲狀、分枝狀等多種形態(tài)。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，支原體感染發(fā)生率達(dá)30％～60％，隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，組織、細(xì)胞、疫苗等受支原體污染的現(xiàn)象越來越普遍。
污染細(xì)胞最常見的支原體包括：發(fā)醉支原體（M.fementans）、豬鼻支原體（M.hyorhinis）、口腔支原體（ M.orale ）、精氨酸支原體（ M.arginina ）、梨支原體（M.pirum）、唾液支原體（M.salivarium）和人型支原體（M.hominis）。被這些支原體污染的細(xì)胞常常不引起明顯的細(xì)胞病變，也不導(dǎo)致培養(yǎng)液渾濁，難以憑肉眼發(fā)現(xiàn)，因此，建立一種高效、快速、敏感度高的檢測方法十分必要。
支原體的檢測方法有很多種，《中國藥典》中支原體檢測方法包括培養(yǎng)法、DNA熒光染色法，其他方法還有酶法、PCR法、ELISA法、間接免疫熒光試驗(yàn)、生化檢測法、直接血凝試驗(yàn)、探針法、放射自顯影法等。每種方法各有利弊，不同方法的支原體檢出率也有差別，一般在5％ ～87％之間。本次講述培養(yǎng)法、DNA熒光染色法、PCR法檢測。
方法：配制支原體培養(yǎng)基，取1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，接種于液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)，同時(shí)觀察是否有混濁或pH值改變。2周后，分別取0.1 mL液體培養(yǎng)液涂在瓊脂平板上，倒置于37 ℃厭氧箱培養(yǎng)，至少3周，持續(xù)觀察是否有支原體菌落出現(xiàn)，有圓形無色透明菌落出現(xiàn)為陽性。
評價(jià)：此法是較早采用的方法。在固體瓊脂培養(yǎng)基、半固體或液體培養(yǎng)基上培養(yǎng) Vero、NIH3T3 等易被支原體污染的細(xì)胞株，可在其中分離到支原體菌株。培養(yǎng)法得到支原體菌株是最可靠的陽性指標(biāo)。該方法的缺點(diǎn)是靈敏度低，不能檢測到種屬且不適用于檢測所有支原體。
方法：
①制備標(biāo)本。首先，在六孔板中制備蓋玻片細(xì)胞培養(yǎng)物，然后將待測細(xì)胞接種到蓋玻片上，用培養(yǎng)液培養(yǎng) 1 ～ 2 d。采用有支原體污染的細(xì)胞作陽性對照，無支原體污染的細(xì)胞作陰性對照。
②固定。首先，吸出培養(yǎng)液，用新鮮配制的 1∶3冰醋酸 /甲醇固定液固定 15 min；然后，吸出固定液后重復(fù)固定一次；最后，吸除固定液室溫下干燥。
③染色。用 pH值 7.2的 PBS稀釋Hoechst33258儲存液，使終濃度為 5μg/ml；然后將染液滴加到固定好的細(xì)胞上，室溫下避光染色 30 min。
④洗滌。用雙蒸水浸泡染色過的蓋玻片 3次，每次 3 ～ 5 min。⑤封片。滴加 1滴含 50%甘油的檸檬酸緩沖液( pH值 5.5)到染色過的細(xì)胞表面，然后將蓋玻片上有細(xì)胞的一面朝下，覆蓋在載玻片上。⑥觀察。在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光分布狀態(tài)，判斷有無支原體污染及污染程度。
評價(jià)：利用熒光燃料 Hoechst33258 能與DNA 特異性結(jié)合的性質(zhì)，在熒光顯微鏡下觀察被支原體污染的細(xì)胞時(shí)，除細(xì)胞核外，在細(xì)胞膜上及細(xì)胞之間也有熒光顆粒。熒光染色法分為直接法和間接法兩類，直接法即用染色劑將待測細(xì)胞直接染色；間接法指在無污染指示細(xì)胞中加入待測細(xì)胞上清液，進(jìn)行混合培養(yǎng)后再染色，因此間接法的靈敏度高于直接法。
方法：采用酚氯法提取待測細(xì)胞DNA，引物為常見污染支原體種類16sRNA的保守區(qū)域序列，長度472 bp，引物A：5’-GGCGAATGGGTGAGTAACACG-3’，引物B：5’-CGGATAACGCTTGCGACCTATG-3’。PCR總反應(yīng)體積為25 μL，加入PCR緩沖液、氯化鎂、Taq酶、dNTP、模板和引物。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性25 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s， 循環(huán)30次后，72 ℃恒溫7 min。取9 μl擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μl 10×Loading Buffer混合后，加入含0.5 μg/ml溴化乙錠的1.5％瓊脂糖凝膠，75V電泳25 min，用紫外檢測儀觀察并用凝膠成像系統(tǒng)照相，有目的片段出現(xiàn)為陽性。
評價(jià)：PCR 法是目前常用的支原體污染檢測方法，其原理是根據(jù)具有支原體種或?qū)偬卣鞯暮怂嵝蛄校ㄒ话阌?16S rRNA）設(shè)計(jì)引物，經(jīng)預(yù)變性、擴(kuò)增、延伸后得到擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)后，通過凝膠上條帶的位置進(jìn)行判斷待測物是否感染了支原體。PCR 法靈敏度高，檢測時(shí)間短，操作簡便，但仍然存在一定缺陷：如易出現(xiàn)假陽性或假陰性等。近年來出現(xiàn)了兩步法 PCR 檢測支原體污染的方法，即在第一次 PCR 的基礎(chǔ)上，再進(jìn)行第二次 PCR。其原理與 PCR 理相同，只是分別采用外引物 (outer p rimer) 和內(nèi)引物 (inner primer) 分兩輪進(jìn)行擴(kuò)增，相對于傳統(tǒng) PCR 法而言，其準(zhǔn)確性、特異性和靈敏度均有所提高。
細(xì)胞制劑質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)檢測項(xiàng)目至少包括內(nèi)毒素檢測、無菌檢測、支原體檢測、細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞存活率、細(xì)胞表型等的檢測。支原體檢測在質(zhì)檢中也具有很重要的地位。支原體感染細(xì)胞后一般難于清除，事實(shí)上，被支原體污染的細(xì)胞，即使污染被清除，細(xì)胞原有的生物學(xué)特性，如基因的表達(dá)、抗原性和代謝特點(diǎn)也隨之發(fā)生了相應(yīng)的改變，會對研究結(jié)果造成嚴(yán)重影響。為了保證細(xì)胞體系免受污染的影響，關(guān)鍵是加強(qiáng)預(yù)防盡可能減少污染的發(fā)生，一般需要在培養(yǎng)液中加入抗生素；另外，清潔的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和良好的操作習(xí)慣，優(yōu)質(zhì)的試劑，如血清、培養(yǎng)基等都是很重要的。
產(chǎn)考文獻(xiàn)： [1] 盧勇，賈繼宗，唐靜等.3種支原體檢測方法的比較.中國生物制品學(xué)雜志.2015.10
